张大丙 教授
3i;\i O#P9L%[S0近年来，3型鸭甲肝病毒（duck hepatitis A virus type 3，DHAV-3）广泛流行于我国许多养鸭地区，故开展该型病毒研究具有重要意义，而构建DHAV-3的感染性克隆，可为深入研究DHAV-3的分子致病机制提供必要的技术平台。
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ee h L8`e1q8@0利用DHAV-3 C-GY株基因组序列设计引物，经RT-PCR扩增得到3个覆盖全长的片段，测序验证后，连入pWSK29载体，构建全长质粒pWSK-GY。测序结果表明，除遗传标记外，病毒基因组无其他任何突变。将全长质粒线性化，体外转录后转染BHK-21细胞，培养48 h后镜检，未见细胞病变，符合DHAV-3自然毒株的特点。荧光抗体染色结果显示，转染细胞18 h后，病毒蛋白已获表达。此外，将培养24 h的细胞上清接种于10日龄鸭胚，可见鸭胚在48~72 h死亡，胚体广泛出血，与DHAV-3自然毒株所引起的病变一致。结果表明，细胞培养液中存在病毒，意味着病毒获得拯救。收获死胚尿囊液，并在鸭胚上连续传代。提取亲本病毒以及第1~10代拯救病毒的RNA进行RT-PCR，均能扩增出DHAV-3的靶基因。酶切分析和测序结果表明，第1~10代拯救病毒均含遗传标记，除遗传标记外，第3代拯救病毒与亲本病毒的全序列一致。结果表明，拯救病毒为含遗传标记的DHAV-3。取45只3日龄雏鸭，随机分为3组，分别注射第3代拯救病毒和第6代亲本病毒，剂量为104ELD50/mL，设阴性对照，试验期为1周。结果显示，用拯救病毒感染雏鸭复制出鸭病毒性肝炎，雏鸭发病情况、临床表现和病理变化与亲本毒一致。中和试验结果显示，第3代拯救病毒和第6代亲本病毒均可被DHAV-3抗血清所中和。结果表明，DHAV-3拯救毒株与自然毒株具有相同的致病性和抗原性。中国水禽网5MmM$Gj)v:KW
